用户文章 STTT -乳腺癌来源的外泌体传递lncRNA诱导CD73+ γδ1 Treg细胞的产生

论文标题：Breast cancer-derived exosomes transmit lncRNA SNHG16to induce CD73+γδ1 Treg cells发表杂志：Signal Transduction and Targeted Therapy(STTT)影响因子：14.39研究机构：浙江大学医学院附属第二医院联川提供：外泌体lncRNA芯片检测服务背景介绍

尽管与其他具有强免疫原性的实体恶性肿瘤（例如黑色素瘤、肺癌和结直肠癌）相比，乳腺癌（BC）被认为是冷性肿瘤（cold tumour），即乳腺癌被认为很少有免疫细胞浸润，科学家们仍在关注乳腺癌的免疫疗法和免疫微环境方面研究，并且随着单细胞RNA-seq分析和大规模细胞计数技术的出现，近来对乳腺癌内的免疫微环境系统有了更好的研究和阐明。研究人员发现，一些免疫亚群与乳腺癌预后高度相关，并有可能成为治疗靶标。在本研究中，研究团队发现CD73+γδT1细胞是BC中占主导地位的调节性T细胞(Tregs)并由BC细胞诱导.。此外，团队发现BC细胞通过外泌体长链非编码RNA(lncRNA) SNHG16的转移促进γδT1细胞中SMAD5的表达，它通过miR-16-5p发挥ceRNA作用，从而增强TGF-β1/SMAD5通路，上调CD73水平。研究结果表明，靶向CD73+γδT1细胞或阻断肿瘤细胞外泌体(TDEs)可能是未来BC治疗的一种策略。
流程图


实验技术手段

细胞分离培养，流式细胞技术，细胞增殖、体外细胞毒性试验及阻断试验，胞外腺苷检测，酶联免疫吸附测定，外泌体分离和转移试验，ELISA，lncRNA芯片检测，CIBERSort和生物信息学分析，免疫印迹法，RT-qPCR，质粒构建和siRNA沉默，双荧光素酶报告分析，RNA结合蛋白免疫沉淀法，RNA原位杂交，透射电镜术，统计分析。
研究结果

1 γδ1T细胞是乳腺癌中肿瘤浸润的关键淋巴细胞
作者检测了不同分子亚型(ER PR、HER2和三阴性，每亚型10例患者) 的BC组织和对照正常组织样本中γδT细胞的比例。发现在所有分子亚型的肿瘤组织中浸润淋巴细胞的数量明显高于对照正常组织(p<0.01，图1a)。此外，当检测CD3时，Vδ1+T细胞在所有三种BC分子亚型中占大多数肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的大部分(P<0.01，图1b，c)，而非Vδ2+T 。此外冷冻切片免疫荧光证实了Vδ1+T细胞在BC中的优势分布（图1d)。图1

作者使用TCGA乳腺癌转录组和预后数据集进行CIBERSort分析，估计肿瘤浸润γδT细胞的丰度。根据丰度结果，将样品分为三组（高、中和低)，作者发现高丰度的γδT细胞是一个不利的因素，提示无疾病生存DFS（the disease-free survival）和总生存数OS（overall survival）减少（图1e，f)。

图1
2 乳腺癌浸润Vδ1+T细胞表型的测定此项研究中作者的目的是通过评价从乳腺癌患者外周血(PBBCs)、正常乳腺组织(NT)和乳腺癌(BC)组织（图2a-d)中分离出的Vδ1/2T细胞和Vδ1/2T细胞的调节免疫细胞标记物(CD27、CD25、CD39、CD73、CTLA-4、CD122和FoxP3)的表达，探索是否有一个特定的亚型Vδ1T细胞在BC发挥主要的免疫抑制发挥重要作用。作者发现无论是肿瘤还是正常的BC组织，所有的调节细胞标记都在增加，但在浸润Vδ2+T细胞中只有CD73和FoxP3表达增加。此外，与来自健康献血者的外周血（PBHDs）的Vδ1/2T细胞中的CD73表达相比，PBBC的Vδ1/2T细胞中的CD73表达增加，在NT中其次，在BC中最高（图2e) 。同时，作者评估了从PBBCs（20例）中分离出的Vδ1T细胞的这些免疫抑制标记物的水平。有趣的是，手术后10-14天CD73表达明显降低(P<0.0001，图2g)，表明CD73的表达与肿瘤负担有关。图2

3  CD73+Vδ1T细胞发挥免疫抑制功能，依赖腺苷介导的途径
为了进一步证明CD73+Vδ1T细胞具有强大的免疫抑制功能，作者从新鲜BC组织中对CD73-Vδ1和CD73+Vδ1T细胞进行了分类。如图所示（图3a）CD73+Vδ1T细胞对CD3+T细胞的增殖有很大的抑制作用，但对CD73-Vδ1T细胞没有(p<0.001)。此外，与CD4+，CD25+调节细胞相似，作者发现肿瘤浸润的CD73+Vδ1T细胞可以抑制CD4+T细胞的IFN-γ分泌（图3b)及CD8+T细胞中的Perforin和颗粒酶B分泌（图3c，d)。综上所述，这些数据表明CD73+Vδ1T细胞不仅在数量上且在有效性上是人类BC中的主要调节细胞。
图3
先前的研究表明CD39和CD73是将细胞外ATP水解成腺苷的胞外核苷酸酶，腺苷是一种典型的、非常强的免疫抑制性剂。与作者以前在结肠癌中的结果相似，乳腺肿瘤组织中腺苷水平远高于正常组织(P<0.01，图3e)。令人惊讶的是，作者还发现了腺苷水平与CD73+Vδ1T细胞比呈正相关(R2=0.70，p<0.05，图1。3f)。然后作者评估了不同肿瘤浸润免疫细胞(CD73+Vδ1T、CD73-Vδ1T和CD4+CD25+T细胞)与CD3+T细胞共培养的上清液中胞外腺苷的含量，发现相比在其他细胞类型的存在下发现，CD73+Vδ1T细胞存在时腺苷含量最高（图3g)。为了证实CD73+Vδ1T细胞是否通过腺苷途径发挥免疫抑制作用，在细胞加入或者不加入A2A腺苷受体拮抗剂SCH58261和A2B拮抗剂PSB603情况下，进行了细胞增殖试验。结果表明SCH5826和PSB603的加入解除了CD3+T细胞的增殖抑制（图3h)。总的来说，这些数据表明CD73+Vδ1T细胞介导的免疫抑制作用主要依赖于腺苷途径。图3
4 乳腺癌细胞通过外泌体和TGF-β途径诱导Vδ1T细胞中CD73的表达作者发现与BCCs跨膜共培养可提高Vδ1T细胞水平，而在GW4869存在下，这一效应被显著抑制（图4a)。此外， Vδ1T细胞中的CD73 mRNA水平也被检测到，阴性结果表明转录后的调控机制参与其中（图4b)。此后，被分离出来的外泌体通过透射电镜和CD9和CD63的Western blotting鉴定了BCCs的上清液及其典型特征（图4c，d)。然后收集乳腺肿瘤细胞衍生外泌体(TDEs)并用PKH26标记（图4e）。流式细胞术分析表明，从PBHDs中分离出的Vδ1T细胞占TDEs的大多数。此外，Vδ1T细胞与TDEs共培养，但结果表明仅TDEs单独存在时不能促进Vδ1T细胞CD73的表达（图4f，g)。图4之前的研究表明：SMAD3/5等转录因子可以结合到CD73的启动子区，因此作者假设在肿瘤微环境中高表达的两种因子：TGF-β1或BMP4可以作为这种相互作用的催化剂。 为了证实这一点，作者在TGF-β1(10ng/ml)或BMP4(10ng/ml)和细胞存在下重复了共培养试验，用SB-431542(10μm，1h)或多索吗啡(10μm，1h)预处理。 令人惊讶的是，TDEs加上TGF-β1或BMP4明显促进了Vδ1T细胞中CD73的表达，但只有TGF-β1受体抑制剂SB-431542阻断了BCC共培养中CD73的上调（图4f，g)。TGF-β1信号通过TGF-RB2和TGF-RB1受体(ALK5)转导，激活SMAD2/3，而BMP通过I型受体(ALK1、-2、-3和-6)转导信号以激活SMAD1/5/8的通路。 然而，在上皮细胞和恶性细胞研究中已经发现将TGF-β1与SMAD1/5连接的非典型信号。因此，上述实验结果表明，TGF-β1与SMAD1/5之间的串扰以及TDEs与TGF-β1/SMAD通路激活之间的串扰协同作用，增强了Vδ1T细胞中CD73的表达。

5 TDEs转移lncRNA SNHG16增强Vδ1T细胞中SMAD5的表达

外泌体能富集非编码RNA，被认为是调节免疫微环境的重要载体。作者发现，与来自MCF-10A细胞的外泌体相比，来自TDEs(MCF-7和MDA-MB-231)的14个lncCRNA表现出更高的表达(与MCF-10A衍生的外泌体比差异倍数大于4倍，图5a)。此外，作者发现这些基因的表达水平在外泌体和细胞之间是不相同的（图5b) 这也在其他研究中也提及到。随后，用lncRNA特异性siRNA转染BCCs，RT-PCR证实这些lncRNAs的表达在外泌体中也受到抑制（图5c）。然后，分离TDE并与Vδ1T细胞共培养，作者的发现表明，除了SNHG16外，其他三种lncRNA都不能调节CD73的表达（图5d,e）。证明TDEs通过传递lncRNA SNHG16诱导Vδ1T细胞中CD73的表达。图5
6 SNHG16海绵吸附miR- 165p上调SMAD5的表达

为了进一步阐明SNHG16促进SMAD5表达的机制，作者使用lncATLAS(http://lncatlas.crg.eu/)预测SNHG16的亚细胞定位。这些结果推测SNHG16主要位于所有可用细胞系的细胞质中（图6a)。其次，定量RT-PCR分析证实SNHG16主要定位于HEK293T和Vδ1T细胞的细胞质内，这也用FISH得到了证实（图 6c)。基于上述结果，作者假设SNHG16在这里作为竞争性内源性RNA(ceRNA)。Ago2被认可作为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心效应蛋白，参与miRNA介导的mRNA不稳定或翻译抑制；因此，用抗Ago2抗体，采用RIP法进行RIP检测。结果表明，与对照IgG-RIPs相比，SNHG16在AGO2-RIPs中富集（图6d，p<0.01)，表明SNHG16作为CeRNA上调Vδ1T细胞中CD73的表达

采用双荧光素酶分析，观察到miR-16-5p、miR-17-5p、miR-93-5p和miR-424-5p降低了pmirGLO-SNHG16的荧光素酶活性，表明该酶具有较好的抑制作用。这些miRNAs可以通过它们各自的miRNA结合位点直接与SNHG16结合（图6e)。。但miR-16–5p 显著下降（图6f)。RIP检测发现与对照IgG免疫沉淀相比，SNHG16和miR-16–5p均富集在AGO2的AGO2免疫沉淀中（图6g)。 这些结果证明SNHG16直接“海绵”吸附miR-16–5p。
图6
综上所述，这些结果揭示了外泌体SNHG16/miR-16-5p/SMAD5-调节轴的存在，从而增强了TGF-β1/SMAD5通路的激活,从而诱导CD73在Vδ1T细胞中的表达（图6h)。
图6
总结

团队从中国患者中收集了40个配对的BC和正常组织样本进行分析。首先，作者发现γδT1细胞在BC中占CD3T细胞的大多数；其次，作者发现CD73 γδT1细胞是BC的主要调节性T细胞(Treg)，其在外周血中的流行也与肿瘤负荷有关。此外，CD73γδT1细胞具有免疫功能腺苷生成抑制作用。作者还发现BC可以以非接触的方式调节γδT细胞上CD73的表达。LncRNA芯片分析和功能实验表明乳腺肿瘤细胞衍生外泌体(TDEs)可将上调CD73表达的lncRNA SNHG16传递给Vδ1T细胞。在该机制中，SNHG16通过海绵吸附miR-16-5p行使ceRNA的作用，导致其靶基因SMAD5的去抑制，并导致TGF-β1/SMAD5通路的增强，从而上调Vδ1T细胞中CD73的表达。作者的结果表明，BC衍生的外泌体SNHG16/miR-16-5p/SMAD5-调节轴增强TGF-β1/SMAD5通路的激活，从而诱导CD73在Vδ1T细胞中的表达。该研究团队首次确定了CD73+ γδ1Treg在乳腺癌中的重要性，并且针对该亚群或阻断肿瘤细胞衍生的外泌体（TDEs）的疗法将来可能具有乳腺癌治疗的潜力。
该文章由联川项目经理王春兰解读

王春兰，主要负责浙江等地区项目，自2016年6月加入联川生物以来，已经服务过600+客户，累计完成项目1100+。对待客户真诚耐心，对待项目严谨认真，得了很多客户好评，从入职以来业绩一直在公司名列前茅，近三年总业绩排名第一，被公司同事外号为销售女神。

【我想说的】

凡事认真，负责，耐心，努力皆有好的结果。不管什么项目，什么性格的客户，只要用心、真诚对待，客户都会感受到。我们联川生物有扎扎实实服务全球客户14年多的项目经验，有全球首创的测序和分析技术，有过硬的服务质量和实力，再加上联川大集体所体现出来的服务意识赢得了很多铁杆客户的青睐和支持，也给信任我们客户带来一个个良性循环，这也是我们联川人为之奋斗努力的源泉，‘’项目交给我们您放心‘’是一种自信更是一种责任！

有内外一致的服务理念，即使每天再辛苦，再怎么加班加点也不觉得累。真心感谢每位支持、信任我们的老师，没有你们就没有我们努力的动力。也非常感谢背后的同事辛苦付出，有这么一群有共同目标共同价值观的同事，相信这股凝聚力能让我们创造更多惊喜！

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